Aperçu du western blot

Le western blot est la technique permettant d’identifier des protéines d'intérêt dans un échantillon en utilisant l’électrophorèse sur gel pour séparer les protéines de l’échantillon. Cette technique a ouvert la voie de la science biomédicale en fournissant une approche très précise de la détection des protéines. Le western blot a été un outil crucial dans la détection des signes cliniques de la maladie de Lyme et du VIH.

Dans cette série, nous allons détailler les éléments fondamentaux du western blot, en donnant un aperçu de l’équipement et des techniques permettant de réussir un blot. Dans cette première partie, nous allons vous présenter le processus de l’électrophorèse et la sélection de vos systèmes de transfert et de vos solutions tampons idéals.

Qu’est-ce qu’un western blot ?

Le western blot est un processus qui détecte des protéines spécifiques dans un mélange de protéines complexe extrait de cellules ou de tissus. Cette procédure biomédicale remonte à 1979 et elle constitue désormais un standard de l'industrie pour l'analyse des protéines. Le western blot a été utilisé dans des percées en examinant la maladie de Lyme et l’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) et les complications dans l'absorption des nutriments.

Le flux de travail du western blot comprend trois étapes principales : la séparation par taille, le transfert sur un support stable et la visualisation à l'aide d’anticorps appropriés.

Le western blot est tout simplement le processus utilisé pour identifier des protéines via une séparation par électrophorèse. Ceci est réalisé en transférant des protéines depuis un gel sur une membrane où les protéines d’intérêt peuvent être détectées avec précision.

La membrane est traitée avec des anticorps, liant des épitopes sur la protéine cible. Après un traitement avec un anticorps secondaire, les protéines ciblées de l’échantillon peuvent être visualisées à l'aide de techniques de détection telle que la méthode de la chimioluminescence améliorée (enhanced chemiluminescence (ECL)).

C’est un processus quelque peu long, requérant plusieurs étapes d’incubation et de lavage. Toutefois, par une compréhension approfondie, vous pouvez gagner du temps et consommer moins de réactifs et d’échantillons avec la bonne technique.

Séparation des protéines par électrophorèse

L’électrophorèse est un processus de séparation des particules dans un substrat de gel en influençant la charge des particules avec un champ électrique. Elle est couramment utilisée par les spécialistes en biochimie et en biologie moléculaire pour détecter et isoler la présence d’une protéine spécifique dans un mélange d’échantillons complexe.

L’électrophorèse est une technique utilisée pour séparer les protéines par la charge. Elle est utilisée pour analyser la composition de mélanges de protéines complexes ou pour vérifier la pureté d’échantillons de protéines. La séparation par électrophorèse peut également servir à purifier des protéines destinées à des applications ultérieures.

Par exemple, l’électrophorèse sur gel peut être utilisée pour séparer des nanoparticules et plus spécifiquement des macromolécules (ADN, ARN, protéines). Le gel est utilisé pendant l’électrophorèse en tant que milieu anticonvectif ou milieu de tamisage, ce qui facilite l’isolement et l'analyse des macromolécules basés sur leur taille.

Certaines variables doivent être prises en compte lors de la préparation d’une séparation par électrophorèse. Il est important de comprendre les bons paramètres pour réussir la séparation selon la constitution de vos échantillons et les objectifs de votre échantillon purifié. Des variables telles que la taille des pores, la charge de la protéine et la forme déterminent le taux de migration de la protéine.

Dans l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, les protéines migrent en réponse à un champ électrique à travers les pores d’une matrice de gel de polyacrylamide ; la taille des pores diminue avec l’augmentation de la concentration d’acrylamide. L’électrophorèse sur gel présente un avantage, car le gel est facile à verser et ne dénature pas l’échantillon. S'il est manipulé correctement, un échantillon peut être récupéré après le traitement. Toutefois, si le gel fond au cours de l’électrophorèse, le tampon peut s’épuiser, ce qui entraîne l’écoulement des échantillons sous des formes imprévisibles.

Transfert des protéines sur la membrane

L’étape du western blot suivant l’électrophorèse est le transfert des protéines. Les protéines seront déplacées d’une matrice de gel sur une membrane synthétique servant de support où elle est liée, formant le blot. Ceci est couramment exécuté via un transfert par électrophorèse.

La membrane et le gel sont placés ensemble, une barrière composée d’un papier filtre étant placée entre les deux électrodes. Une tension est appliquée ensuite entre les électrodes, incitant les protéines à migrer sur la membrane en suivant le courant d’électricité.

Le taux d’élution des protéines depuis le gel est déterminé par la force du champ électrique (mesuré en V/cm). Les conditions de transfert dépendent du poids moléculaire des protéines cibles et doivent être prises en compte dans la décision de sur-transférer ou de sous-transférer un échantillon. Un certain nombre d'options est donc disponible pour les systèmes de transfert en fonction de vos besoins.

Systèmes de transfert par cuve

Le transfert par cuve est la méthode la plus courante, offrant la plus grande plage de réglages de puissance, de temps de transfert (30 minutes - du jour au lendemain) et la plus grande gamme de systèmes de refroidissement intégrés. Ces attributs rendent possible la manipulation d'une grande plage de tailles de molécules. Les gels et les membranes sont totalement submergés dans ce système requérant 1 à 12 litres de tampon et un assemblage manuel.

Systèmes semi-secs

Dans les systèmes semi-secs, les gels et les membranes sont placés entre des papiers filtres imbibés de tampon, qui sont directement en contact avec des électrodes plates. Légèrement plus faciles à mettre en place que les systèmes à cuve, ils ne nécessitent qu’un assemblage manuel. Dû à l'absence d'options de refroidissement, il existe des limites en termes de puissance et de temps de transfert (options de 15 à 60 minutes). Ces systèmes sont l'idéal pour les molécules dont la plage est comprise entre 30 et 120 kD et ne requièrent que 250 ml de solution tampon par blot.

Systèmes de transfert rapide

Les systèmes de transfert rapide sont la technologie la plus récente sur le marché et offrent les temps de transfert les plus rapides (3 à 10 minutes). Similaires au système semi-sec traditionnel, les systèmes de transfert rapide utilisent des papiers filtres et des membranes qui sont pré-imbibés et préparés dans un emballage à usage unique.

Ceci simplifie l'assemblage du tas de transfert et nécessite une mise en place manuelle minimale, voire nulle. Les techniques de transfert semi-sec permettent une plus grande personnalisation des paramètres de transfert, les rendant encore plus pratiques pour une large plage de poids moléculaires des échantillons. Aucun réactif tampon supplémentaire n’est nécessaire.

Blocage des sites non spécifiques

Après le lavage et l'incubation des anticorps, le blocage est la phase la plus cruciale du western blot pour garantir des résultats précis. Le blocage est un élément clé de la phase de l'immunodétection du western blot, car il évite la liaison non spécifique des anticorps sur la membrane de transfert.

Après le transfert des protéines du gel, il est important de bloquer la surface restante de la membrane pour éviter la liaison non spécifique des anticorps. Ceci assurera la lisibilité des résultats.

Le blocage est souvent réalisé avec de l’albumine de sérum bovin (BSA) ou du lait en poudre sans matières grasses dilué à 5 % dans une solution saline tamponnée de Tris avec du Tween 20 (TBST) pour réduire le bruit de fond et produire des résultats clairs. Selon les marquages de détection utilisés, les protéines de lait sont souvent une solution de blocage non compatible. La compréhension de cette compatibilité sera importante pour réaliser un western blot viable.

Formulations des tampons de lavage

Pour réussir le blot, il est nécessaire de choisir la meilleure solution tampon de lavage pour le blocage, car les différentes solutions ont des avantages et des inconvénients. Ce choix repose sur trois facteurs : la protéine d'intérêt, l’anticorps et le système de détection utilisé.

Théoriquement, vous pouvez utiliser tout tampon sans affinité pour se lier à la protéine cible ou à des composants de la sonde. Toutefois, certaines solutions tampons auront de meilleurs résultats que d'autres. Par exemple, les solutions de blocage BSA seraient le choix idéal si vous utilisez des marquages d’anticorps de biotine et AP avec des anticorps anti-phosphoprotéine. Le lait contenant de la caséine (une phosphoprotéine et biotine elle-même), une solution de blocage à base de lait interférerait avec les résultats de l’essai.

Plusieurs tampons de blocage courants sont utilisés dans le western blot :

• Lait écrémé en poudre
• Albumine de sérum bovin (BSA)
• Sérum normal (sérum fœtal de veau, de lapin, de cheval ou de chèvre)
• Gélatine de poisson
• Caséine purifiée
• Polyvinylpyrrolidone (PVP)
• Tampons commerciaux

La solution tampon la plus couramment utilisée est le sodium dodécyl sulfate (SDS), bien que le tampon SDS entraîne certaines complications lors de l’analyse de certaines protéines. Les protéines comme l’Immobilon-P traverseraient le plan de la membrane en présence de SDS. L'utilisation du SDS comme tampon fonctionne le mieux dans les cas où les protéines tendent à précipiter.

Lors de l’exécution d'un western blot, certaines solutions tampons incluent un pourcentage de méthanol qui aura ses avantages et ses limites dans certains cas.

Le méthanol aide à dépouiller le SDS des protéines transférées depuis des gels de polyacrylamide contenant du SDS dénaturant. Ceci stabilise la géométrie du gel pendant le transfert et peut augmenter la capacité de liaison entre les protéines et la nitrocellulose (NC) dans la membrane. Le méthanol aide également à lier les protéines à la membrane. Le méthanol ne convient pas pour transférer des protéines dont le poids moléculaire est élevé ou pour préserver l'activité des enzymes. C’est ainsi car le méthanol tend à réduire le gel.

Le transfert sans méthanol est aussi idéal lors du transfert d’anticorps sensibles à conformation. Lors de l’utilisation d’un tampon à faible force ionique sans méthanol, il est important d’incuber le gel pendant 30 à 60 minutes avant le transfert. En procédant ainsi, vous évitez tout risque de gonflement pouvant déformer les bandes et altérer la lisibilité des résultats.

Dans la plupart des cas, l’incubation de l’anticorps primaire avec de la BSA est une bonne pratique, car celui-ci est généralement nécessaire en plus grande quantité que l’anticorps secondaire. Ceci permettra ainsi de réutiliser l'anticorps si le blot ne procure pas de résultat viable.

Conclusion

Bien que le western blot soit une technique complexe de détection des protéines, Avantor dispose des ressources nécessaires pour permettre le fonctionnement sans heurt de votre projet de western blot. Avantor peut vous fournir tout ce dont vous avez besoin lorsqu’il est question de sélectionner la meilleure technologie de western blot sur le marché. Nous facilitions l'approvisionnement, vous pouvez donc vous concentrer pour donner à votre équipe la capacité d'innover aisément.