Méthodes de sélection et de détection d’anticorps par la technique du western blot

Anticorps primaires et secondaires

Les liaisons d'anticorps sont essentielles dans la liaison et la détection des protéines dans le Western Blot. Les anticorps primaires sont introduits au début du processus afin qu'ill se lient à la protéine d'intérêt. L'anticorps primaire peut être conjugué à un colorant ou à une enzyme pour la phase de détection, mais si rien n'est ajouté, un anticorps secondaire devient nécessaire. Les anticorps secondaires sont utilisés pour détecter l'anticorps primaire dans le milieu. Les deux anticorps doivent être dirigés contre l'espèce hôte, ce qui signifie que si le primaire est un monoclonal de souris, le secondaire devra être anti-souris. L'utilisation d'un anticorps secondaire à la place d'une méthode de détection par enzyme ou colorant peut permettre d'économiser du temps et des ressources. L'utilisation d'anticorps primaires et secondaires permet de procéder plus tard à leur retrait.

Le retrait des anticorps (ou "blot stripping") présente trois avantages principaux. Cette technique élimine les anticorps primaires et secondaires du blot qui a été utilisé pour détecter une protéine. Ceci permet au blot d'être à nouveau sondé pour permettre la détection de protéines supplémentaires sur le même échantillon.

De plus, le retrait peut être utilisé pour détecter un contrôle de charge sur le même blot. Cela annule l'erreur ou le biais de l'utilisateur dans la détection des niveaux de la protéine cible dans l'échantillon.

Enfin, le retrait génère une plus grande efficacité dans la technique de blot, puisque le même échantillon peut être réutilisé. La possibilité de réutiliser des échantillons aide à optimiser la concentration d'anticorps sans gaspiller temps ou matériel à exécuter plusieurs analyses et transferts sur gel.

Il y a quelques éléments à considérer lors de la mise en place d'un protocole de retrait. Les méthodes de "décapage" nécessitent une combinaison de détergent, d'agent réducteur, de chaleur ou de tampons à faible pH pour affaiblir les interactions antigène-anticorps. Un retrait réussi devrait laver les anticorps, tout en évitant les interférences au niveau des interactions protéine-membrane.

Le choix de la membrane, la méthode de détection, la méthode de retrait et la séquence de détection des protéines doivent être compatibles. Le retrait ne réussit qu'en utilisant des méthodes de détection telles que l'électrochimiluminescence (ECL) ou les méthodes de fluorescence, contrairement aux méthodes colorimétriques qui laissent des taches visibles sur la membrane. Il est recommandé de privilégier l'utilisation d'anticorps de faible affinité pour détecter les protéines en faible abondance. Ceci est dû au fait que chaque retrait supplémentaire sur un même gel entraîne inévitablement une perte d'antigène.

Lors de la réutilisation d'un blot, il est important de bien laver la membrane dépouillée avant de la réutiliser, puis de la rebloquer pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps à la membrane.

Méthodes de détection

La détection sur un Western blot est la technique qui rend possible la visualisation des résultats. Les méthodes de détection fonctionnent de plusieurs manières ; par une réaction enzymatique, ou par des anticorps conjugués visualisables directement.

Technique colorimétrique

La colorimétrie fonctionne en produisant un précipité coloré au moyen d'une réaction enzymatique. Cette technique est généralement plus facile à utiliser et ne nécessite pas de matériaux coûteux tels qu'un film radiographique ou un révélateur. La colorimétrie a une plage de picogrammes inférieure à celle d'autres techniques et offre ainsi une plage de sensibilité aux environs des 5 à 500 pg de protéines, avec un seul signal de sortie.

Chimiluminescence

La chimiluminescence est une méthode de détection très sensible, plus couramment utilisée que les méthodes colorimétriques. La lumière est générée comme sous-produit d'une réaction entre un substrat chimique et une enzyme. L'intensité de la lumière est ensuite mesurée par exposition à un film radiographique ou à un dispositif à couplage de charges (CCD) convertissant les photons en un signal électronique.

Il existe deux méthodes de Chimiluminescence avec chacune ses avantages et inconvénients. La chimiluminescence par détection avec film est une méthode très sensible de détection des protéines dans la gamme des femtogrammes. C'est une méthode plus coûteuse, nécessitant un film, un entretien du développeur et une chambre noire. Les rayons X/CCD sont généralement plus faciles à utiliser et plus linéaires que les films, mais nécessitent souvent un équipement plus coûteux et une formation approfondie.

Fluorescence

La fluorescence est la méthode de détection la plus largement utilisée à ce jour dans le Western Blot. Plutôt que de compter sur une réaction enzymatique pour produire un signal, les anticorps sont conjugués à un fluorophore spécifique, qui peut être analysé à l'aide d'un système d'imagerie.

<>Cela permet une plage de linéarité bien plus grande que les méthodes de détection précédentes. La fluorescence permet de sonder plusieurs protéines à la fois, à l'aide de divers fluorophores. On peut gagner un temps considérable en étant capable de sonder des protéines qui fonctionnent à un poids moléculaire similaire.

 

Actuellement, il existe plusieurs systèmes d'imagerie parmi lesquels choisir pour détecter les résultats d'un Western blot fluorescent, tels que la lumière visible, les LED ou les lasers infrarouges.

Systèmes de transfert d'électrons

Au-delà des méthodes de transfert en cuve ou semi-sèches, il existe une grande variété de méthodes de transfert à utiliser dans ces systèmes. Aujourd'hui, la méthodologie la plus populaire est l'electroblotting, ou électrotransfert. Cette méthode de transfert rapide et efficace peut être utilisée sur des systèmes de transfert humides, semi-secs et secs.

Un système de transfert d'électrons est mis en place avec le gel en contact direct avec un morceau de membrane formulé pour la liaison aux protéines. Ces deux couches sont ensuite placées entre deux électrodes, qui sont soit immergées dans un tampon (systèmes de cuve), soit recouvertes de papiers filtres saturés de solution tampon (systèmes secs et semi-secs).

Lors de l'électrotransfert, un champ électrique est généré, provoquant le déplacement des protéines du gel vers la surface de la membrane, où elles se lient au milieu.

Transfert en cuve (humide)

Les transferts humides représentent la méthode traditionnelle de transfert, nécessitant une fenêtre de temps de transfert plus longue de 30 à 120 minutes. L'utilisation d'un tampon est essentielle pour cette technique, faisant souvent appel à une solution de méthanol. Cela implique des protocoles de nettoyage plus poussés et l'élimination des matières dangereuses après le transfert.

Semi-sec

Les transferts semi-secs sont nettement plus rapides qu'un transfert en cuve standard, ne prenant que 7 à 10 minutes environ. Des tampons sont toujours nécessaires, mais ne requièrent pas de méthanol pour fonctionner correctement. Cette technique très polyvalente permet un processus légèrement plus facile, avec moins de temps d'arrêt et de nettoyage. L'un des plus grands avantages du transfert semi-sec est que plusieurs méthodes peuvent être utilisées, créant ainsi une opportunité de personnalisation du protocole.

Electroblotting sec

Le transfert à sec ne nécessite aucune solution tampon et offre le temps de transfert le plus rapide : de 5 à 7 minutes au total. Cette méthode utilise une matrice de gel qui incorpore un tampon, plutôt que des cuves ou des papiers filtres imbibés. Les systèmes de transfert à sec sont incroyablement faciles à utiliser, avec des transferts de haute qualité et des besoins minimes en matière de nettoyage par rapport aux autres méthodes de transfert.

Avantages & inconvénients du transfert d'électrons

Sensibilité et précision

La technique du Western blot offre la possibilité de détecter des protéines aussi petites que 0,1 nanogramme dans un échantillon, ce qui en fait un outil idéal pour les diagnostics précoces. Cette sensibilité accrue réduit également le besoin d'anticorps, nécessitant moins de tests et réduisant considérablement les coûts de laboratoire.

Le Western blot est également fiable et précis pour la détection des protéines. En effet, l'électrophorèse trie les protéines de l'échantillon par taille, charge et conformation. La spécificité est également soutenue par l'interaction anticorps-antigène, qui facilite la détection d'une protéine cible dans un mélange complexe. Cela peut être fait avec plus de 300 000 protéines différentes présentes dans un échantillon donné.

Résultats subjectifs et demandes coûteuses

Bien que le Western blot puisse fournir des résultats précis, il peut également produire des données trompeuses s'il y a des erreurs dans la mise en oeuvre de la technique. De faux positifs peuvent survenir en raison d'un anticorps réagissant avec une protéine non désirée, comme dans le cas d'infections parasitaires. De même, un faux négatif peut se produire lorsque des protéines plus grosses ne reçoivent pas un temps de transfert suffisant.

Lorsque les techniques de blot sont imprécises, elles produisent souvent des bandes décolorées et asymétriques qui sont sujettes à interprétation par un(e) technicien(ne) de laboratoire. Il est important d'avoir des tests de contrôle et de comprendre chaque étape du processus du Western blot afin d'obtenir des résultats clairs et fiables.

Une formation et un équipement de laboratoire appropriés sont nécessaires pour réussir un blot. Comprendre les concentrations de réactifs, les temps d'incubation et les protocoles de détection nécessite une formation approfondie et les manipulations doivent être effectuées par du personnel de laboratoire qualifié.

Conclusion

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